SEÑALIZACIÓN GENERADA POR FOSFOLÍPIDOS Y CALCIO (IV): REGULACIÓN MEDIADA POR CALMODULINA, CAMK Y CALCINEURINAS. TRANSPORTE DE CALCIO A LA MITOCONDRIA

CALMODULINA

Una de las funciones más importantes del calco es regular la actividad de la calmodulina. La calmodulina es un receptor intracelular de calcio que activa una gran variedad de proteínas una vez esta es activada, a su vez, por el aumento de calcio citosólico.

Su estructura es la de una proteína con abundantes hélix alfa, y muy flexible, capaz de adaptarse a la morfología de otras proteínas. Presenta cuatro dominios de interacción con el calcio, dos por cada lóbulo. En los dominios de interacción con el calcio, encontraremos aminoácidos ácidos (que permitirán, mediante la interacción de las cargas con signo opuesto, la interacción). Una vez se produce esta, la calmodulina se activa y puede a su vez activar otras proteínas que podrán desarrollar diversas rutas de señalización celular. Las principales funciones de la calmodulina son las siguientes:

• Metabolismo de nucleótidos cíclocos: Activa a la fosfodiesterasa, el adenilato ciclasa (tipo I, más abundante en neuronas) o la NO sintetasa (síntesis de NO, activador de la guanilato ciclasa soluble, por lo tanto, se producirá un aumento de cGMP).
• Fosforilación de proteínas: Como CAMK, MLCK y Glicógeno fosforilasa quinasa.
• Desfosforilación de la Calcineurina.
• Activa el transporte de calcio mediado por la proteína transportadora ATPasa cálcica, lo que acaba con la señal, feedback negativo.

Ejemplo de activación proteica mediado por la Calmodulina

Ca-CAMK

• Son Ser/Thr quinasa dependientes de calcio (y activadas por calmodulina).
• Ejemplos: CAMK I, II, IV, MLCK (quinasa de la cadena ligera de la miosina), y otras multifuncionales, las cuales presentan especificidad de sustrato bastante amplia.
• La autofosforilación es el primer paso de su activación debido a la unión con Ca-CAM (necesario para su conformación activa).

Tipo de CAMK	Ejemplos de sustrato	Efectos
I	Quinasas de cadena ligera de la miosina.	Contracción muscular lisa
II	Tirosina hidroxilasa Glicogen fosforilasa quinasa RYR Otros…	Síntesis de neurotransmisores. Degradación del glicógeno. Salida del calcio por los receptores RYR
IV	CREB y otros factores de transcripción.	Regulación de la expresión génica.

CALCINEURINA

• Presenta actividad Ser/Thr fosfatasa.
• Desfosforila los factores de transcripción NF-ATs, lo que permite su translocación al núcleo, para poder regular a ciertos genes importantes en la morfogénesis y desarrollo, la respuesta inmunitaria, etc…
• La calcineurina es la diana terapéutica de muchos fármacos inmunorepressores como Ciclosporina A.

Trasnlocación al núcleo del factor de transcripción NF-AT gracias a la fosfatasa Calcineurina

CAPTACIÓN DE CALCIO POR LA MITOCONDRIA

• El uso de EGTA (un quelante del calcio), nos permite asegurar que fuera no habrá calcio, o que este no será capaz de entrar.
• Como consecuencia de la histamina, el calcio cambiará, de forma muy rápida.
• La mitocondria podrá regular la entrad de calcio, proveniente del retículo, inducido como respuesta a hormona. Por eso, podemos observar que el pico de calcio en la mitocondria está desplazado ligeramente en el tiempo (en presencia de EGTA, gráficas C y D).

Estos gráficos pertenecen, respectivamente, a: calcio citosólico, calcio mitocondrial (sin EGTA), calcio citosólico, calcio mitocondrial (con EGTA). 

¿Pero como entra el calcio a la mitocondria, proveniente del RE? Como ya hemos comentado, la célula tiene un sistema que permite que el RE quede muy próximo a la mitocondria, cosa que facilitará el transporte del ion. Este proceso de aproximación está controlado por las mitofosinas, que tienen como función asociar algunas vesículas del RE con la mitocondria.

En el retículo tendremos un receptor de IP3 (IP3R), y en la mitocondria un canal uniporte capaz de llevar calcio a la matriz mitocondrial (únicamente, transporte de fuera a dentro) ... Como este transporte se produce contra gradiente, debemos disponer de energía en forma de gradiente electroquímico (de protones, fuerza protomotriz) para poder hacer entrar al calcio.

Esquema del transporte de calcio entre el RE y la mitocondria, mediado por las mitofusinas.

Deberíamos hacernos otra pregunta. ¿Qué regula el calcio en la mitocondria? Principalmente, actúa como regulador de actividades que tienen como objetivo la obtención de ATP. Eso lo consigue regulando y activando enzimas como la piruvato deshidrogenasa y otras deshidrogenasas del ciclo de Krebs. Con todo, obtendremos acetil-CoA, más NADH+H⁺, y podremos generar mayor fuerza protomotriz, para sintetizar más ATP.

LIPOGÉNESIS (II): BIOSÍNSTESIS DE LOS FFA

La biosíntesis de los TAGs está mediada por dos enzimas, la Acetil-CoA carboxilasa i la Ácido graso sintasa (esta última es un complejo multienzimático. Parece ser que la evolución ha sido capaz de integrar una gran gama de enzimas aisladas que catalizaban diversas reacciones de biosíntesis en este complejo).

ÁCIDO GRASO CARBOXILASA

• La regulación de la Ácido graso carboxilasa está mediada de forma positiva por la insulina (que induce su polimerización y la activa), y el citrato. De forma negativa , existe la regulación por glucagón y catecolaminas, y de los propios FFAs de cadena larga, por feedback negativo, induciendo la enzima a un estado monomérico e inactivo.
• El ácido graso carboxilasa regula la reacción de carboxilación del acetil-CoA para convertirlo en Malonil-CoA, y para ello requerirá de un aporte de energía (ATP), y de un ion carbonato.

Reacción de carboxilación del acetil-CoA a malonil-CoA

ÁCIDO GRASO SINTASA (FAS, Fatty Acid Sintase)

• Su mecanismo de acción es muy parecido al de la β-oxidación, pero al revés. (Acil activado + Malonil-CoA, la diferencia respecto a la β-oxidación).
• La estructura es en forma de dímero. Cada subunidad está a su vez conformada por 2 partes, un dominio de condensación y otro de reducción. Ambos dominios, tendrán un grupo -SH que tendrá como función la de unirse y transportar los grupos acilo entre las dos subunidades. Eso será posible gracias a la disposición asimétrica (no enantiomérica) de las dos subunidades del dímero (el dominio de condensación se hallará justo enfrente del dominio reductor de la otra subunidad, permitiendo la cercanía de los dos grupos -SH y por lo tanto, la trasferencia del acilo. Destacar que el grupo -SH del dominio reductor se encuentra unido a ACP, que actúa de la misma forma que CoA.

Estructura del complejo FAS.

Las reacciones catalizadas por el complejo FAS son las siguientes:

1. Partiremos con una molécula de malonil-CoA (sintetizada a partir de la reacción vista antes) y otra de acetil-CoA. Esta última se convertirá en Acetil-ACP mediante el intercambio de su grupo CoA con uno ACP (unido a la enzima) con la ayuda de la enzima Acetil transcilasa.
2. El Acetil-ACP cederá su grupo al malonil-CoA, que se transformará en malonil-ACP (se liberará un grupo CoA), todo ello mediado por la enzima Malonil transacilasa. El acetil que ha cedido su grupo ACP se quedará unido a la enzima, justamente en el otro grupo -SH del complejo multimérico, en el grupo sulfhidrilo unido a la cisteína.
3. A continuación, se produce la unión entre el Malonil-ACP y el acetil unido a la enzima, gracias a la enzima β-cetoacil ACP sintasa. Hay que destacar dos hechos. El primero, que se producirá una descarboxilación, liberándose CO₂, y el segundo, que los carbonos que provienen del acetil se unirán a ACP. Por ese motivo, la cadena crecerá de dentro hacía fuera, o dicho de otra manera, los grupos unidos al principio a la cadena se encontraran más lejos del grupo ACP al final de la síntesis. Como producto de esta reacción, obtendremos una molécula de β-cetoacil-ACP (con más o menos carbonos conformándola, según el número de vueltas que llevemos).
4. .Más tarde, se reducirá el β-cetoacil-ACP a β-d-hidroxiacil-ACP, usando lógicamente poder reductor (que como ya habíamos adelantado, se trata del NADPH+H⁺) y a su vez, la reacción será mediada por la enzima β-cetoacil-ACP reductasa. Nótese que la configuración de la molécula es D, mientras que, en la lipólisis, uno de los intermediarios tenía que ser L.
5.  Después, la molécula de β-d-hidroxiacil-ACP se deshidratará a α-β-trans-enoil-ACP, implicando la formación de un doble enlace, reacción catalizada por β-d-hidroxiacil-ACP deshidratasa.
6. La α-β-trans-enoil-ACP pasará a convertirse en una molécula de Acil-ACP al reducirse (de nuevo, necesitaremos poder reductor, NADPH+H⁺), con la ayuda de la enzima β- enoil-ACP reductasa.
7. Finalmente, el Acil-ACP se convertirá en Acil-enzima (o sea, se transferirá al otro dominio de la FAS, en el grupo -SH unido a la cisteína), gracias a la acción de nuevo de la Acetil transacilasa. En este punto del mecanismo, se pueden elegir entre dos rutas. Una consistirá en empezar una nueva vuelta, al unirse una nueva molécula de malonil-CoA al acilo (habiéndose unido previamente al grupo ACP del dominio reductor de FAS), empezando de nuevo las reacciones que acabamos de ver, o, llegados a este punto y contando con una cadena larga de carbonos, se puede deshidratar de nuevo el acilo, mediante la acción de la enzima tioesterasa (que forma pat de FAS pero no se encuentra en ninguno de los dos dominios que se han descrito antes), obteniendo como producto un ácido graso (por ejemplo, si este cuenta con una cadena de 16 carbonos, será una molécula de ácido palmítico.

Esquema de la biosíntesi de los FFA. Los enzimas son, respectivamente:

1, Acetil transcilasa, 2,Malonil transacilasa, 3, β-cetoacil ACP sintasa, 4, β-cetoacil-ACP reductasa, 5, β-d-hidroxiacil-ACP deshidratasa, 6, β- enoil-ACP reductasa, 7, tioesterasa. 

LIPOGÉNESIS (I): TRASNFERENCIA DEL ACETIL-CoA

CONCEPTOS GENERALES

• Lipogénesis es el nombre que recibe el proceso de síntesis de FFAs. Se produce por condensación de moléculas de acetil-CoA. Estas moléculas no pueden proceder de la β-oxidación, ya que esta vía estará inhibida cuando haya lipogénesis. Por ese motivo, la formación de acetil-CoA será a partir de sustratos NO lipídicos, como glucosa o aminoácidos.
• ¿Dónde se produce? Principalmente, en los animales, esta sucede a nivel del hígado, donde se acaban produciendo TAGs, que saldrán en forma de VLDL (lipoproteínas de muy baja densidad). Estas lipoproteínas se trasladarán a el TAB (tejido adiposo blanco), el cual también tiene maquinaria de biosíntesis lipídica (menos relevante), ya que su función principal es de lipólisis. No obstante, el mayor consumidor será el músculo esquelético y cardiaco, que actuará como sumidero principal. A nivel subcelular, podemos hallar la siguiente distribución (diferenciamos entre células animales y vegetales):

Distribución del metabolismo lipogénico a nivel celular.

• La lipogénesis es una vía citosólica, cuyo precursor es el malonil-CoA (que incorpora un acetil-CoA). Requiere NADPH+H⁺ (poder reductor que requerirá, para ser producido, de la ruta de las pentosas-fosfato, o de la actividad de la enzima málica).

TRASNFERENCIA DEL ACETIL-CoA A TRAVÉS DE LA MEMBRANA MITOCONDRIAL

¿De donde proviene el acetil-CoA que usaremos durante la lipogénesis? De la mitocondria, ya que lo habremos obtenido a partir de la reacción de conversión del piruvato a acetil-CoA, catalizada por la piruvato deshidrogenasa. No obstante, tenemos un problema, puesto que el acetil-CoA No puede travesar la membrana mitocondrial. Por ese motivo, necesitaremos la ayuda de otro compuesto, el citrato, para poder realizar dicho transporte (nótese en los siguientes pasos, que gran parte de las reacciones forman parte del ciclo de Krebs):

1. El acetil-CoA de la matriz mitocondrial se une al oxalacetato, todo ello catalizado por la citrato sintasa, produciendo citrato (el primer paso del ciclo de Krebs).
2. El citrato puede travesar la membrana interna mitocondrial por una proteína transportadora llamada “citrate transporter”. La membrana externa es muy porosa y el citrato no tendrá ningún problema para traspasarla.
3. Ya en el citosol, y mediado por la citrato liasa, junto con la adición de una molécula de CoA y el uso de una molécula de ATP, se producirá Oxalacetato y acetil-CoA (por lo tanto, se habrá liberado este compuesto al citosol, objetivo del ciclo que estamos describiendo. El resto de los procesos consistirán en el etorno al interior de la mitocondria).
4. El Oxalacetato, usando el poder reductor de una molécula de NADH+H⁺ y todo ello mediado por la enzima MDH (Malato deshidrogenasa), se convertirá en malato. Este compuesto podrá volver al interior de la matriz mitocondrial, gracias a la presencia de un transportador llamado “Malate-α-ketoglutarate transporter”. No obstante, hay otra posibilidad de ruta, que será explicada en el paso 6.
5. A continuación, el malato se oxidará a oxalacetato (compuesto inicial del ciclo) mediado de nuevo por la enzima MDH, produciendo poder reductor en forma de NADH+H⁺.
6. El Malato citosólico, en lugar de entrar directamente hacía la matriz mitocondrial, puede seguir otra vía metabólica, que incluirá una reacción de descarboxilación para formar piruvato y poder reductor en forma de NADPH+H⁺ (muy importante este hecho, puesto que antes hemos comentado que la lipogénesis utiliza el NADPH+H⁺ como poder reductor). Esta reacción de formación de piruvato será catalizada por la enzima málica dependiente de NADP⁺. El piruvato podrá traspasar la membrana mitocondrial interna por el transportador “pyruvate transporte”, e internalizarse en el interior de la mitocondria.
7. El piruvato se convertirá en oxalacetato mediante na reacción de carboxilación, usando un ATP y gracias a la acción de la piruvato carboxilasa. Con la obtención de oxalacetato (también en el paso 5), habremos completado el ciclo.

Esquema del proceso de transferencia del acetil-CoA a través de la membrana mitocondrial.

DEGRADACIÓN DE LÍPIDOS (VI): CUERPOS CETÓNICOS

Consideramos tres moléculas diferentes:

• Acetona: No nos sirve como precursor catabólico, la eliminamos a través de la orina o a través de la respiración.
• Acetoacetato: Se sintetiza en el hígado (a nivel de las mitocondrias).
• D-β-Hidroxibutirato: Se consume en los tejidos extrahepáticos, cuando estamos alimentados en el corazón y la corteza renal, o en ayunas, en el cerebro (actúan como sustitutos de la glucosa).

Los cuerpos cetónicos tienen uso en situaciones durante las cuales hay un aumento significativo de la concentración de acetil-CoA, que empezará a tener problemas para entrar dentro del ciclo de Krebs debido a la disminución de OAA (oxalacetato), usado para la gluconeogénesis, para formar glucosa y exportarla (evidentemente, estamos hablando a nivel del hepatocito). El acetil-CoA deberá concurrir por otra ruta, al no poder entrar en el ciclo de Krebs, y por ello pasará a formar cuerpos cetónicos (Acetona, acetoacetato y D-β-Hidroxibutirato). Estos compuestos serán exportados fuera del hepatocito, y serán utilizados como fuente de energía por el corazón, tejidos musculares, riñones, y especialmente, el cerebro (sobre todo en situación de ayuno).

Circuito de las rutas que puede seguir el acetil-CoA, en situación de bajos niveles de oxalacetato.

SÍNTESIS DE LOS CUERPOS CETÓNICOS

• Para la síntesis de los cuerpos cetónicos partimos con dos moléculas de acetil-CoA, que mediante la enzima Tiolasa (específica de acetil-CoA, y que también puede funcionar al revés), condensará las dos moléculas en un acetoacetil-CoA.
• A continuación, el acetoacetil-CoA se transformarà en HMG-CoA (el cual puede participar en la síntesis del colesterol (cuando se produce a nivel del citosol de la célula), todo mediado por la enzima β-Hidroxi-β-metilglutamil-CoA-sintetasa, y a partir de la adición de un acetil-CoA más y la pérdida de un grupo CoA.
• Después, la enzima HMG-CoA liasa catalizará la transformación del HMG-CoA en acetoacetato, desprendiéndose en el proceso una molécula de acetil-CoA.
• Llegamos a un punto de bifurcación, puesto que la molécula de acetoacetato podrá seguir dos rutas metabólicas diferentes. Por una banda podrá convertirse en acetona por descarboxilación espontanea, liberando una molécula de CO₂. Por la otra, y mediante la acción de la D-β-Hidroxibutiratodeshidrogenasa, el acetoacetato podrá convertirse en D-β-Hidroxibutirato, gastando en el proceso poder reductor (NADH+H⁺). En realidad, la proporción de NAD+/ NADH+H⁺ a nivel de la mitocondria determinará la proporción de acetoacetato/ D-β-Hidroxibutirato.

Esquema de la síntesis de los CC

DEGRADACIÓN DE LOS CUERPOS CETÓNICOS

Para degradar este tipo de moléculas, seguiremos un camino muy parecido al de su síntesis, pero a la inversa:

• Partimos con una molécula de D-β-Hidroxibutirato, que se convertirá en acetoacetato (obteniendo poder reductor, NADH+H⁺) mediado por la enzima D-β-Hidroxibutiratodeshidrogenasa de nuevo.
• El acetoacetato deberá convertirse en acetoacetil-CoA, y para ello necesitaremos una transferasa llamada β-cetoacetil-CoA-transferasa, que utilizará una molécula de succinil-CoA para obeten su grupo CoA, y la transformará en succinato (la reacción inversa de la catalizada por la succinil-CoA sintetasa, del ciclo de Krebs).
• De nuevo, y mediante la aportación de un nuevo grupo CoA, convertiremos la molécula de acetoacetil-CoA en dos moléculas de acetil-CoA, mediante la acción de la tiolasa.
• Finalmente, los acetil-CoA podrán entrar al ciclo de Krebs, y producir energía y poder reductor.
• Esta degradación solo puede llevarse a cabo a nivel de tejidos extrahepáticos, puesto que en hígado no se ha encontrado actividad transferasa, y por ese motivo no se pueden degradar cuerpos cetónicos.

Esquema de la degradación de los CC

CETOSIS DIABÉTICA

1. La cetosis diabética empieza cuando hallamos el páncreas parcialmente destruido.
2. Eso implicará una mayor concentración de glucosa en sangre y en la orina (además por razones osmóticas, también aumentará la presencia de iones como el sodio o el potasio).
3. Aumento de la lipolisis a nivel del TAB, produciendo un aumento de la presencia de FFA en sangre. Eso inducirá una falsa situación de ayuno en organismo.
4. El hígado empezará a utilizar el exceso de FFA para poder sintetizar cuerpos cetónicos.
5. Debido al carácter ácido de los cuerpos cetónicos, se producirá una acidosis metabólica.
6. Para mantener la homeostasis del organismo, y neutralizar el pH, se necesitará mayor concentración de CO₂ para que este actúe como tamponador, habrá hiperventilación.
7. Si no se trata, el paciente podrá entrar en coma y morir. Este tipo de diabetes (I) puede tener base autoinmune.

SUSTANCIAS ASIMILADAS. EL FLOEMA (II):MECANISMOS DE CARGA Y DESCARGA

CARGA SIMPLÁSTICA

• Vía plasmodesmos, a través de otras células, hasta llegar a las células de la vaina (después habrán los vasos vasculares o parénquima vascular). Finalmente, las sustancias transportadas llegarán a la célula acompañante y posteriormente a la célula cribosa, para iniciar, así, su transporte a través del floema.
• Requerimiento: Tenemos que tener conexiones con plasmodesmos (las células acompañantes tendrán que estar abiertas, y se requerirá de un gradiente de sacarosa).
• Un ejemplo de circuito simplástico puede ser el siguiente: Células del mesófilo (fuente), células de la vaina, células acompañantes (se puede producir la síntesis de galactoligosacáridos, uniendo moléculas de galactosa a la sacarosa, para formar, por ejemplo, raffinosa), y células cribosas (aquí empezará el transporte a través del floema).

Esquema de la carga simplástica.

CARGA APOPLÁSTICA

• En un punto determinado, la sacarosa saldrá a nivel del apoplasto.
• También puede deberse a que las células acompañantes no tienen plasmodesmos con las siguientes células.
• Se trata de un mecanismo de transporte activo, ya que se requerirá de una bomba de protones que mantenga la fuerza protomotriz para asegurar el simporte de sacarosa y protones (por transportadores como SUC y SUT).

Mecanismos de la carga apoplástica.

DESCARGA DEL FLOEMA

La descarga del floema puede ser, al igual que la carga, de dos tipos:

• Simplástica: En el meristemo apical del tallo y la raíz, o en hojas jóvenes. Cuando los asimilados se consumirán con rapidez, y se podrá mantener el gradiente.
• Apoplástica: La salida al apoplasto tendrá lugar cuando no exista la posibilidad de utilizar la ruta simplástica (ausencia de plasmodesmos). Generalmente, se produce cerca de la célula o tejido objetivo, los cuales siempre son de reserva (no hay conservación del gradiente).

Tipos de descarga floemática.

CUADRO COMPARATIVO ENTRE EL XILEMA Y EL FLOEMA

	Xilema	Floema
Tipo de células	Muertas, lignificadas, estructuras que pueden aguantar presiones negativas muy fuertes	Vivas y especializadas
Mecanismo de transporte	Transpiración	Gradiente de presión (fuente sumidero)
Sustancias transportadas	Agua y sales minerales (también presencia de otras sustancias típicamente floemáticas, pero en menor concentración)	Azúcares, aa, fitohormonas, enzimas, ácidos orgánicos, iones, moléculas señal, etc
pH	5,5~6	7,3~8

SUSTANCIAS ASIMILADAS. EL FLOEMA (I):CONCEPTOS GENERALES

Transporte por el Floema:

• Composición: Azúcares (sacarosa y otros oligosacáridos, como pueden ser la raffinosa, la stachiosa y la verbacosa, formados a partir de sacarosa y la adición de un, do  o tres residuos de galactosa respectivamente, o manitol en algunas plantas rosáceas, el cual es un azúcar alcohol), aminoácidos (especialmente amidas, como la asparragina o la glutamina, aunque algunas leguminosas también transportan ureidos, los cuales poseen una mejor relación carbono nitrogeno), fitohormonas, enzimas, ácidos orgánicos, iones (excepto nitrato y sulfato, aunque hay gran cantidad de potasio), moléculas señal, etc. Algunos de estos compuestos, en menor concentración, se pueden hallar en el xilema, debido a puntos de anastomosis. El pH suele ser ligeramente alcalino (7,3~8).
• Siempre, se trata de un transporte de que se origina en la Fuente (donde se produce la síntesis, como hojas y algunos tejidos de reserva), hacía el sumidero (constructivos, como SAM, el meristema apical del tallo, o RAM, el meristema apical de la raíz, y de reserva, como los frutos y algunas partes de la raíz).
• Bidireccional, de la base al ápice y al revés.
• Debe existir proximidad entre el sumidero y la fuente, o encontrarse en una parte común de la simetría y estrcutura de la planta.
• Estadio de desarrollo (las hojas jóvenes actúan como sumideros y las hojas maduras como fuente). Lo mismo pasa con muchos tejidos de reserva, especialmente en plantas bienales, que tienen un ciclo vital de dos años).
• Conexiones vasculares directas para que el transporte sea posible. Bajo ciertos estreses, y mediante procesos de anastomosis como los comentados anteriormente, se puede hacer llegar recursos a otras regiones de la planta.
• Estructura. La unidad funcional está constituida por dos tipos de células. Por una banda existen las células que constituyen elementos del tubo criboso, SE, que en realidad son células vivas, que contienen un citoplasma sin vacuolas, núcleo, ribosomas (solo tienen REL, mitocondrias modificadas, y todos los orgánulos dispuestos a la parte lateral de la célula), proteínas P (un tipo de fibra), y placas cribosas en el extremo (ponen resistencia al transporte). Se pueden taponar con callosa). Por la otra, hay las células acompañantes, CC, las cuales están conectadas mediante plasmodesmos a las células cribosas, hacen síntesis de proteínas señal, como algunos factores de transcripción que regulan el crecimiento de la planta, y también poseen sensores para poder modular el fotoperíodo (en el floema de hojas maduras).

MECANISMO QUE IMPULSA EL TRANSPORTE A TRAVÉS DEL FLOEMA

El sentido de transporte de la savia floemática siempre se dirige de mayor a menor presión, o en otras palabras, de fuente a sumidero.

1. Cuando se carga la sacarosa, se produce una disminución del potencial de solutos y del hídrico, ergo habrá una entrada de agua, y un aumento de presión, a nivel de la fuente.
2. Cuando se produce la descarga de los asimilados, hay un aumento del potencial de solutos, produciendo un aumento del potencial hídrico y una salida de agua, disminuyendo así la presión y creando el gradiente entre la fuente y el sumidero.

Esquema del transporte vascular de las plantas

SEÑALIZACIÓN GENERADA POR FOSFOLÍPIDOS Y CALCIO (III): EL CALCIO COMO MENSAJERO SOLUBLE

Cuando hablamos de movilización del calcio y de regulación, en realidad nos referimos a los mecanismos de su almacenamiento y transporte. El objetivo será conocer como transportamos ese calcio de un compartimento a otro. Los cambios de Calcio pueden ser de diferente índole y magnitud, puntuales o importantes, y se pueden transmitir.

FLUJOS CELULARES DEL CALCIO

En el citoplasma, el calcio siempre se encuentra a niveles muy bajos, del orden de 0,1μM. ¿Como podemos variar esa concentración?

• Flujo de entrada de Calcio: Encontramos una gran concentración de calcio a nivel del RE (Retículo Endoplasmático), hasta 0,4 mM, el cual está generalmente ligado a proteínas como la Calsecuestrina o la Calreticulina (cada proteína puede albergar hasta unos 50 iones de calcio). Esta unión es de carácter reversible, y se puede deshacer. Entonces, el calcio podrá abandonar el RE y llegar al citoplasma saliendo por RyR y IP₃R. El medio externo aún es más rico en calcio (alberga una concentración del orden de 1 o 2mM), y también sirve como reservorio de este. El calcio extracelular podrá entrar por canales regulados.
• Flujo de salida de Calcio: Una vez ha actuado el Calcio, y sus niveles a nivel citoplasmático se han visto incrementados, la célula deberá volver a sacarlo del citoplasma, puesto que unos niveles demasiados elevados de este ion pueden llegar a ser tóxicos y desencadenar procesos de muerte celular. Una ruta de salida será el bombeo (conta gradiente) de la proteína SERCA hacia el RE (requerirá de gasto energético). También, a través de PMCA (otra bomba de calcio que requerirá gasto energético directo), o un transportador antiporte (entran 3Na⁺ y sale Ca²⁺) podremos enviar Calcio al medio extracelular.

Flujo del Calcio celular

DETECCIÓN DEL CALCIO

Para poder detectar los niveles de Calcio, teniendo en cuenta que este se encuentra a muy poca concentración, será necesario que contemos con métodos muy sensibles:

• Fluorescencia: Usaremos un compuesto llamado Quin-2 (o también existe FURA). Se trata de un compuesto de carácter lipofílico que podrá atravesar la membrana citoplasmática. Una vez dentro de la célula, y debido a la acción de ciertas enzimas citosólicas, se verá alterada su naturaleza lipofílica (pasará a ser hidrofílica), y no podrá escapar de la célula. Además, cuando se incrementen los niveles de Calcio citoplasmático, la sonda lo detectará, produciendo un pico. La bajada de ese pico indicará el proceso contrario, la movilización del calcio citoplasmático hacía otros compartimentos o el mismo medio extracelular.
• Luminiscencia: Más moderno, se basa en una proteína llamada AEQUORINA, la cual emite luminiscencia cuando se une al Calcio. Se puede introducir a la célula mediante un vector de expresión, y además, podemos configurar a ese vector para que se exprese únicamente en un compartimiento concreto de la célula, o a muchos pero con diferentes tonalidades d color, pudiendo así describir aun mejor el mecanismo de transporte de calcio a nivel celular.

CALCIO Y RETICULO ENDOPLASMÁTICO

Existen dos transportadores/recetores que median la salida del Calcio del RE.

IP₃R:

• Canal de Calcio homotetramérico.
• Existen dos tipos diferentes, R1 y R2, con un 69%de homología.
• Un lugar de unión a IP₃ y otro al Calcio por subunidad.
• Especificidad por el ligando: I(1,4,5)P₃, los fosfatos 4 y 5 son claves para el reconocimiento.
• Unión a Calcio citoplasmático, lo cual puede modular la respuesta y acción del trasportador. Si la concentración es muy elevada, mM, perderá sensibilidad, si la concentración es pequeña, μM, la ganará.

RYR:

• Canal de Calcio homotetramérico.
• Existen 3 tipos: RyR1, RyR2, y RyR3.
• Se encuentran el en Retículo endoplasmático y en el sarcoplasmático.
• No responden a IP₃, pero si al Calcio citoplasmático.
• Pueden responder a alcaloides (de forma positiva a la cafeína, y de forma positiva o negativa a la ryanodina, origen de su nombre).
• Presentes en muchos tipos celulares, los mecanismos de su regulación varían según el tejido, aunque es muy importante la regulación del propio calcio citoplasmático (activación o inhibición dependiendo de la concentración de este).

Destacar que se han descrito dianas de fosforilación para ambos transportadores, lo que indica que la fosforilación puede servir como modulador de su actividad.

CALCIO Y EL MEDIO EXTRACELULAR

Existen varios tipos de canales de Calcio que regulan el transporte entre el citoplasma y el medio extracelular:

• Canales de Calcio regulados por el voltaje: Se abren en respuesta al potencial de acción de la membrana celular (abiertos entre -30 y +30mV, célula en reposo tendrá un PA de aproximadamente -90mV).
• Canales de Calcio regulados por el receptor: Tenemos dos tipos, los receptores/canal, como el caso del receptor de glutamato (neurotransmisor), o los receptores regulados por segundos mensajeros (ej: AMPc o GMPc) o proteínas G.
• Canales de Calcio regulados por la concentración de Calcio en el RE: Son los llamados SOCs (Store-Operated-Channel). Están regulados por la concentración del ion a nivel del RE. Parece ser que STIM, una proteína de membrana del RE, cunado disminuye la concentración de calcio a nivel del retículo, cambia la conformación e interacciona con SOCs, lo que permite la entrada de Calcio, que activará otros procesos, aunque aún no se conoce demasiado bien el mecanismo. Herramientas experimentales para estudiar su regulación: Thapsigargina, un inhibidor de SERCA, Lonomycina, ionóforo de calcio a nivel del RE, RETPEN, un agente quelador liposoluble que secuestra el calcio a nivel del RE.

Esquema de la regulación de SOC

SEÑALIZACIÓN GENERADA POR FOSFOLÍPIDOS Y CALCIO (II): FUNCIÓN Y ACTIVACIÓN DE PKC

PROTEINA QUINASA C

Caraceristicas:

• Grupo heterogéneo de Ser-Thr quinasas.
• Especificidad de sustrato amplio (pueden fosforilar muchas proteínas diferentes).
• Relacionada con muchas actividades celulares (una de ellas es la activación de la proliferación celular, por ejemplo en células musculares, donde activa la proliferación y disminuye la diferenciación)

Existen algunas isoformas de esta quinasa, que difieren según sus dominios estrcuturales, aunque todas tienen dominio pseudo-sustrato (el cual puede interaccionar con el dominio sustrato y taparlo):

• cPKC (clásicas). Presentan unión a DAG y a Calcio. Unión de tipo NLS (señal de señalización nuclear).
• nPKC (nuevas). No presentan unión a Calcio.
• aPKC (atípicas). No presentan unión a Calcio ni a DAG. Unión de tipo NLS (señal de señalización nuclear).

Dominios de las diferentes isoformas de PKC

ACTIVACIÓN DE PKC CLÁSICAS

La activación de las PKC (clásicas) sigue una série de pasos:

• Proteina inactiva (localizada en el citoplasma).
• PDK-I, una Ser-Thr quinasa, la cual se encuentra a “upstream” de muchas rutas de señalización celular (regulada por PIP₃), fosforila la nansa de activación de PKC.
• PKC, aun inactiva, se autofosforila a C terminal. El dominio catalítico reacciona con el dominio pseudo-sustrato.
• De forma paralela, las PLC activan la señalización por calcio, aumentando la concentración de este en el citosol. Unión del calcio al dominio de PKC para calcio, permitiendo un cambio conformacional que la translocará a la mebrana.
• Una vez en la mebrana, unión de PKC a DAG. Finalmente, PKC se encontrará activa y podrá fosforilar a sus moléculas diana.

Activación, de forma esquemática, de PKC

¿Cuales son los objetivos de PKC?

• Activar las vesículas de transporte.
• Activar la secreción.
• Activar el tráfico a nivel de membrana plasmática.
• Regular las interacciones membrana/citoesqueleto.
• Regulación de la transcripción (mediante el dominio NLS).
• Activar la proliferación celular (se ha visto que DAG quinasa transforma los DAG en PA, acido fosfatídico, lo cual inactiva a PKC e inhibe la proliferación celular).

SEÑALIZACIÓN GENERADA POR FOSFOLÍPIDOS Y CALCIO (I): FOSFOLIPASAS

FOSFOLIPASAS Y FOSFOLÍPIDOS RELACIONADOS CON LA ACCIÓN HORMONAL

Las fosfolipasas (PL) son enzimas que hidrolizan los fosfolípidos, pero existen diferentes tipos que actúan sobre diferentes enlaces del mismo fosfolípido, generando productos diferentes.

Dianas de las fosfolipasas a nivel del fosfolípido.

• PLA₁: No tiene demasiada importancia des del punto de vista de señalización celular.
• PLA₂: Más importante. Libera ácido Ácido araquidónico i Ácido lisofosfatídico.
• PLC: Hidroliza el enlace situado entre el grupo fosfato y el oxígeno unido al tercer carbono del fosfolípido. Tiene mucha afinidad para los PIP₂ (fosfatidilinositolbifosfato). Los productos originados por la fosfolipasa son un IP₃ (Inositol 1,4,5trifosfato) y un DAG (diacilglicerol).
• PLD: Hidroliza el enlace situado entre el fosfato y el oxígeno unido a R₃. Sus sustratos más comunes son la fosfatidilcolina o la Fosfatidiletanolamina. Después de su acción se pueden generar algunos productos, dependiendo del sustrato, como el DAG activado, si el sustrato era una molécula de fosfatidilcolina.

Sustrato y grupo polar de las diferentes hidrólisis medidas por PLC y PLD

RECAMBIO DE FOSFATIDILINOSITOL

Existe una activación vía hormonas que regula el proceso de recambio de las moléculas de fosfatidilinositol (PIP₂)., un proceso que implica la degradación y la síntesis de estas moléculas. Se descubrió mediante el estudio con P³², i se estableció que a través de las PLC se activaban esas secuencias de recambio del PIP₂. Se puede establecer un ciclo donde se produce un “turnover”, por una banda se sucede la degradación y posterior emisión de señales, y por la otra, la síntesis de novo del PIP₂. Hay que destacar el hecho que este ciclo viene regulado por acción hormonal (acetilcolina). Desembocará en una activación del calcio intracelular vía IP₃, y de la activación de PKC vía DAG.

Esquema del ciclo del recambio del fosfatidilinositol

¿Pero como se puede volver a obtener PIP₂ a nivel de la membrana plasmática? La clave en esta cuestión es entender que estás reacciones suceden en la propia membrana plasmática de la célula. El ciclo se realiza a partir de sucesivas fosforilaciones mediante la acción de quinasas diferentes. Además, el inositol se incorporará desfosforilado. El primer punto importante es aquel que involucra a la DAG quinasa, aunque después, como acabamos de comentar, se deberá realizar aún un mayor número de fosforilaciones para obtener a PIP₂.

FOSFOLIPASA ESPECÍFICAS DE PIP₂

Principalmente, esta familia de fosfolipasas está integrada por 3 especies diferentes:

• PLC-β
• PLC-ε (muy minoritaria, apenas participa en la señalización).
• PLC-γ

Dominios estructurales de las diferentes especies de PLC

Observando los dominios estructurales que presenta cada fosfolipasa podemos dedcuri su función e implicación en la señalización. Los dominios X e Y son los centros catalíticos de la fosfolipasa, C2 es el centro de unión a los fosfolípidos y al calcio, EF-Hand también permite la unión al calcio y RA (dominio que posee únicamente PLC-ε), media la unión a Rap.

¿Qué hace cada proteína?

• PLC-β parece que se activa por GPCR, mediante la interacción con las proteínas G como αq, αi y βγ.
• PLC-ε se unirá a EPAB, activando Rap-GTP.
• PLC-γ Interaccionará a través de sus dominios SH₂ con el receptor Tyr-quinasa. Será fosforilada. La fosforilación provocará un plegamiento a nivel estructural que acercará a los dos dominios catalíticos y le permitirán poder catalizar la reacción sobre PIP₂.

Nótese que hormonas diferentes mediante una señalización basada en diferentes receptores, podrá acabar desembocando a una misma respuesta celular, la movilización del calcio y la activación de PKC.